Anais de Trabalhos Científicos 7º CBHV

Avaliação da sensibilidade da Leishmania (Leishmania) infantum chagasi ao tratamento e profilaxia com Antimonium Crudum

AUTORES

Karinne Marques da Silva (FMVZ - Universidade de São Paulo (USP))

Mauro Javier Cortez Veliz (ICB - Universidade de São Paulo (USP))

Ismael Pretto Sauter (ICB - Universidade de São Paulo (USP))

Andreia Pereira da Costa (FMVZ - Universidade de São Paulo (USP))

Priscilla Anna Melville (FMVZ - Universidade de São Paulo (USP))

Nilson Roberti Benites (FMVZ - Universidade de São Paulo (USP))


RESUMO INTRODUÇÃO

Na busca por alternativas ao uso de medicações alopáticas e vacinas, as quais desencadeiam uma série de efeitos colaterais e consequências indesejadas, o uso clínico e realização de pesquisas da homeopatia vem crescendo de forma singular.
Para a escolha de uma medicação homeopática, utiliza-se o princípio da similitude, de modo a estimular o organismo a reagir curativamente e preventivamente às doenças. No caso das doenças epidêmicas, essa escolha se baseia em um conjunto de sintomas peculiares à epidemia (gênio epidêmico) (1)
A Leishmaniose é um complexo de doenças de extrema importância na atualidade, acarretando de 20.000 a 30.000 mortes por ano. Dentre suas formas, a Leishmaniose visceral tem uma alta taxa de mortalidade quando não tratada. Nesse contexto se faz necessária a pesquisa de novas formas de tratamento e profilaxia que sejam menos tóxicas, mais econômicas e mais efetivas que a forma tradicional (2)
A quantidade de parasitas que são opsonizados pelo macrófago, um dos componentes mais importantes da reposta imune celular na Leishmaniose, depende da interação entre receptores em suas membranas e metaloproteínas presentes nos parasitas (3)
O presente trabalho visa, portanto, avaliar a influência das diferentes potências homeopáticas (CH6, CH12 e CH30) de Antimonium crudum (A. crudum) na interação de macrófagos e L. (L.) infantum chagasi.


MATERIAL / MÉTODO

Para análise estatística dos experimentos em triplicata, foram realizados comparações de Dunn’s Multiple e teste de Fisher através do programa GraphPad Instat.(P< 0,001).
A medicação foi realizada através da diluição de glóbulos impregnados com A. crudum dissolvidos em 15 mL de água miliq autoclavada e filtrada nas potências CH6, CH12 e CH30 e administradas nas culturas (1% do volume final). O grupo controle não continha diluições e no grupo placebo, apenas diluições de glóbulos.
Nos ensaios foram utilizados macrófagos J774, cultivados em meio RPMI 1640 (Vitrocell com 10% de SFB) a 370C e 5% de CO2. Foram mantidos em placas de 24 poços com lamínulas e em cada poço foi adicionado 2,5 x 105 células, aderidas por 12 horas e infectadas com promastigotas de L. (L.) infantum chagasi (MHOM/BR/1972/LD) na proporção de 5:1 (parasitas:macrófagos). Para cultivo do parasita utilizamos meio 199 (Sigma Aldrich), acrescido de HEPES (40 mM), adenina (0,1mM), biotina (0.1 %), hemina (0,1%), soro fetal bovino (SFB - 20%), penicilina/ estreptomicina (1%), L-glutamina (1% ) e urina (2%), pH 7.2, mantidas a 25 0 C e então tratadas, antes ou após a infecção, com a solução homeopática e incubadas por 48, 72 ou 96 horas.
Para imunofluorescência, as lamínulas foram fixadas em 4% de paraformaldeído/PBS e tratadas com 50mM de cloreto de amônia (15 min.), permeabilizadas e bloqueadas com saponina (0,1%)/ albumina de soro bovino ( ;0.1 %)/ azida sódica (0,05%)/PBS e incubadas com solução de permeabilização e bloqueio na presença de anticorpos primários (anti-Leishmania e anti-LAMP1) por 2 horas, seguido da incubação com os respectivos anticorpos secundários (Alexa Fluor 488 e 568 ; Invitrogen) por 1 hora. O material genético dos macrófagos foi corado com 10 µg/ml DAPI (Sigma) por 1 hora. As imagens foram adquiridas (Imagem 1) em um microscópio de fluorescência DMI6000B/AF6000 (Leica) em um sistema de câmera digital (DFC 365 FX), com o programa“Leica AF600” e “Image J” (4)


RESULTADO

Ao constatar-se que o controle era estatísticamente semelhante ao placebo em 83,3 % dos casos, realizamos comparações entre as diferentes potências (CH6, CH12 e CH30) e as relacionou-se com o grupo controle.
Dessa forma, observa-se que:
Em relação a A e B, CH6 e CH12 tiveram maior taxa de fagocitose nos ensaios expostos ao Antimonium crudum após a infecção do que os previamente tratados em 72 horas de incubação. Além disso, com CH12 também houve diminuição da infecção nos experimentos realizados com 48 horas de infecção. Já em relação a CH30, nos experimentos com 72 horas, em relação a A e C, houve um aumento significativo de fagocitose bem como maior porcentagem de células infectadas nos ensaios tratados profilaticamente.
Partindo do pressuposto de que uma maior taxa de fagocitose de parasitas pelo macrófago numa etapa inicial pode estimular maior liberação de fatores quimiotáticos levando a um recrutamento de mais macrófagos, isso levará ao desencadeamento de uma resposta imune secundária mais eficiente contra patógenos intracelulares (3,5)
Portanto, a medicação A. crudum na potência CH30 tem resultados mais satisfatórios, se administrada profilaticamente para o gênio epidêmico da Leishmaniose.Todavia, em se tratando de terapêutica, após a infecção já instalada, a potência CH6 ou CH12 tem um efeito mais significativo por aumentar o poder fagocítico do macrófago em até 72 horas.
Esses dados sugerem que, in vitro, as diferentes potências dos medicamentos homeopáticos possuem diferentes efeitos na cultura celular, sendo administradas antes (profilaticamente) ou após (tratamento) a infecção. Porém, ressalta-se a importância da resposta do organismo do animal no tratamento homeopático, no que se refere à capacidade de curar ou amenizar a sintomatologia clínica das doenças.

ANEXOS


REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

1. Teixeira MZ. Homeopatia nas doenças epidêmicas: conceitos, evidências e propostas. São Paulo; 2010;73(29):36–56.
2. WHO. Leishmaniasis [Internet]. World Health Organization (WHO). 2015 [cited 2015 Jul 1]. Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs375/en/
3. Ueno N, Wilson ME. Receptor-mediated phagocytosis of Leishmania: implications for intracellular survival. Trends Parasitol. 2012;29(6):997–1003.
4. Cortez M, Huynh C, Fernandes MC, Kennedy K a., Aderem A, Andrews NW. Leishmania promotes its own virulence by inducing expression of the host immune inhibitory ligand CD200. Cell Host Microbe. 2011;9:463–71.
5. Kedzierski L, Evans KJ. Immune responses during cutaneous and visceral leishmaniasis. Parasitology [Internet]. 2014;1–19. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25075460

Palavras-chave: Imunidade, cultura celular, homeopatia, prevenção