Anais de Trabalhos Científicos 7º CBHV

Comparação do efeito de Arsenicum album 30 K e 6cH na modulação da fagocitose in vitro

AUTORES

Luciane Costa Dalboni (UNIP)

Fabiana R Santana (UNIP)

Carolina Schultz (UNIP)

Fabiana Toshie Konno (UNIP)

Silvia Waisse (PUC)

Amarylis T César (HNCRISTIANO)

Carla Holandino (UFRJ)

Cideli Coelho (Universidade Sto. Amaro (UNISA))

Leoni Villano Bonamim (UNIP)


RESUMO INTRODUÇÃO

Recentemente, alguns trabalhos identificaram nanopartículas (NP) dos materiais originais nas altas diluições de medicamentos homeopáticos acima do número de Avogadro (6,02 x 10-23)1-2. Além de NP, os medicamentos homeopáticos, tradicionalmente preparados em recipientes de vidro, também contêm NP de sílica 1-2-3. A nanotecnologia utiliza a sílica regularmente, na montagem de nanoestruturas específicas baseadas em DNA, proteínas ou outros materiais como moldes epitáxicos estruturais 4-5.
O objetivo do trabalho é comparar o efeito de diluições homeopáticas de Arsenicum preparadas em recipientes de vidro e plástico. Para tanto, escolhemos como modelo experimental a análise do efeito modulador do medicamento Arsenicum 30K preparado em recipiente de vidro e plástico, no processo de fagocitose in vitro, bem como análise de largura e área através de co-cultura de macrófagos com leveduras. Os resultados serão de extrema relevância para a compreensão do mecanismo de ação dos medicamentos homeopáticos, além de terem implicações práticas altamente significativas para a farmácia homeopática, pois determinarão a possibilidade ou não de substituir vidro por plástico no preparo e estoque dos mesmos.


MATERIAL / MÉTODO

Ética: Por se tratar de estudo 100% in vitro, utilizando células de linhagem, a aprovação do comitê de ética da UNIP não foi necessária.
Co-cultura de macrófagos e leveduras: os macrófagos RAW foram descongelados, distribuídas em garrafas de cultura e incubadas a 37°C com 5% CO2, até a adesão dos macrófagos à superfície da garrafa. As células não aderentes foram removidas por lavagem com tampão fosfato (PBS). Em seguida, foi adicionado à garrafa de cultura o meio RPMI suplementado com 20% de soro fetal bovino, 200U ml-1 penicilina, 100U ml-1 estreptomicina e 2.6 µg ml-1 de anfotericina. As células que atingiram 90% de confluência foram ressuspensas, contadas e plaqueadas em fluxo laminar, o plaqueamento foi feito com pipetador automático e pipetas descartáveis, em placas de 6 poços. Foram inseridos 0,5ml do meio contendo 25x105 células por poço. O inóculo (levedura de pão, Saccharomyces cerevisiae) foi adicionado sobre as células aderidas ao fundo do poço na proporção 10:1 e incubado por duas horas. Após esse período, as células foram lavadas em PBS para remoção dos microorganismos não fagocitados. As amostras foram processadas em triplicata. O tratamento das células foi feito pela inclusão de arsenicum 30K ou lactose 30K (veículo), preparados em água ultra-pura e filtrados em filtro Millipore 22 micra, para completa esterilização, em volume equivalente a 20% do volume total do meio de cultura de cada poço. Após 24 horas, um reforço do tratamento foi feito com 1% do volume, utilizando os mesmos medicamentos. As células foram aderidas diretamente à superfície da placa para evitar a contaminação da cultura com a sílica desprendida das lamínulas, o que aconteceria caso utilizássemos o protocolo convencional de fagocitose.Vários procedimentos foram feitos a partir desta etapa: 1) As células aderidas sobre as placas foram fixadas com metanol absoluto por 15 minutos e coradas com Giemsa.


RESULTADO

Resultados:Os macrófagos RAW tratados com arsenicum album 30K e água dinamizada 30K, ambos preparados em plástico, apresentaram aumento estatisticamente significativo em relação aos controles, no que diz respeito à área celular média (p=0,065; Figura 1) e ao índice fagocítico (p=0,049; Figura 2). Não houve significância estatística em relação à largura das células e ao número de leveduras internalizadas. Para confirmação e avaliação da especificidade deste primeiro resultado, uma repetição foi feita, substituindo-se a água dinamizada por água não dinamizada. Os macrófagos RAW tratados com arsenicum 30K preparado em plástico apresentaram aumento estatisticamente significativo na largura dos macrófagos (p=0.0001; Figura 3) em relação aos controles. Não houve significância em relação ao índice fagocítico e ao “spreading”. Também não houve diferença entre os grupos tratados com água não dinamizada preparada em plástico e vidro, em nenhum dos parâmetros analisados. No terceiro experimento, onde testamos o medicamento Arsenicum album 6cH preparados em vidro e plástico, não obtivemos significância estatística em nenhum dos parâmetros analisados, após 24hs de incubação.Discussão:Com este estudo definimos uma potência homeopática capaz de produzir efeitos mensuráveis in vitro (As 30K), bem como de revelar diferenças entre as preparações farmacêuticas feitas em frasco plástico e frasco de vidro. A dinamização da água como controle pode gerar efeitos inespecíficos que dificultam a interpretação dos resultados, conforme demonstrado em estudos feitos anteriormente in vitro (JAGER et al., 2011). Nossos resultados apontam que tais efeitos inespecíficos sobre a ativação macrofágica são ainda mais evidentes quando da preparação dos medicamentos em frasco PET. Tais dados são compatíveis com a literatura e acrescentam evidências de que o uso do plástico como recipiente para preparação de medicamentos homeopáticos pode comprometer a ação medicamentosa, sobretudo quando usado em grande escala.
Em estudo realizado com células humanas (leucócitos) usando uma linhagem de células (MT4), observou-se que as potências homeopáticas de Arsenicum 6cH e 200cH foram capazes de aumentar a viabilidade de células MT4 in vitro, após intoxicação com arsênico As2O3 (IVE et al, 2012). Em outro estudo avaliou-se o efeito dos medicamentos homeopáticos Arsenicum album e arsênico inorgânico em co-culturas de leucemia monocítica humana com linhagem de células THP-1 in vitro. Como resultado, o medicamento arsênico inorgânico produziu aumento das citocinas pró-inflamatórias IL1-beta e TNF-alfa e baixos níveis de citocina anti-inflamatória IL10 6 .
Concluímos que a natureza do material utilizado como frasco para preparação de medicamentos homeopáticos pode interferir na sua atividade biológica, sobretudo em medicamentos preparados na escala Korsakov.


    REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

    1-Chikramane PS, Suresh AK, Bellare JR, Kane SG. Extreme homeopathic dilutions retain starting materials: a nanoparticulate perspective. Homeopathy, 2010; (99): 231-242.

    2-Upadyhay RP, Nayak C. Homeopathy emerging as nanomedicine. Int J High Dilution Res. 2010 ;( 10):299-310.

    3-Bhattacharyya SS, Madal SK, Biswas R, Paul 2, Pathak S, Boujedaini N, Belon P, KHUDA-BUKHSH AR. In vitro studies demonstrates anticancer activity of an alkaloid of the plant Gelsemium sempervirens. Exp Biol Med. 2008; (233): 1591-1601.

    4-Belton DJ, Deschaume O, Perry CC. An overview of the fundamentals of the chemistry of silica with relevance to biosilicification and technological advances. FEBS J. 2012; (279):1710-1720.

    5-Baca HK, Carnes EC, Ashley CE, Lopez DM, Douhit C, Karlin S, Brinker CJ. Cell-directed assembly: directing the formation of nano/bio interfaces and architectures with living cells. Biochim Biophys Acta. 2011; (1810): 259-267.

    6-Marzotto M, Olioso D, Bonafini C, Bellavite P. 2° International Homeopathy Research Conference. 2015, Riliape Turati Rome Italy. Differential dose-dependent effects of arsenic in pro- and anti- inflammatory citokines. Cutting Edge Research in Homeopathy: Fri 5 june. p. 20.

    Palavras-chave: homeopatia, hipótese da sílica