Anais de Trabalhos Científicos 7º CBHV

Efeito do medicamento homeopático Antimonium crudum na infecção de macrófagos J774 por Leishmania (Leishmania) infantum chagasi

AUTORES

Karinne Marques da Silva (FMVZ - Universidade de São Paulo USP)

Mauro Javier Cortez Veliz (ICB - Universidade de São Paulo USP)

Ismael Pretto Sauter (ICB - Universidade de São Paulo USP)

Andreia Pereira da Costa (FMVZ - Universidade de São Paulo USP)

Priscilla Anna Melville (FMVZ - Universidade de São Paulo USP)

Nilson Roberti Benites (FMVZ - Universidade de São Paulo USP)


RESUMO INTRODUÇÃO

As leishmanioses são doenças parasitárias com ampla variedade de sintomas que vão desde lesões cutâneas com autocicatrização até a forma visceral que pode ser fatal se não tratada. A doença tem distribuição mundial e além de acometimento humano, a leishmaniose canina constitui uma das mais importantes doenças para a veterinária. A forma visceral (LV) é transmitida pela L. infantum e L. donovani (velho mundo) ou L. (l.) infantum chagasi (Novo Mundo) (1)
O principal sistema de tratamento de leishmaniose é a quimioterapia na qual são utilizados Antimoniato de Meglumine, Anfotericina B e/ou Miltefosina, porém, já se sabe que além de serem tóxicos, possuem resistência e baseados nessas considerações, estudos de novos compostos para tratamento da leishmaniose se fazem necessários (2). Embora a homeopatia seja uma opção de tratamento efetiva, segura e oficializada no Brasil ainda existem poucos estudos referentes ao seu uso como opção terapêutica para Leishmaniose.
Santana(2014), demonstrou em seus experimentos in vivo, que o tratamento em camundongos com Antimonium crudum (A. crudum) na potência 30 CH evidenciou uma reação inflamatória local mais suave em resposta a infecção por Leishmania amazonensis, com redução da migração de fagócitos e linfócitos.
Então, o objetivo do presente trabalho foi verificar o efeito do A.crudum em suas diferentes potências (mais utilizadas dentro da prática homeopática) em infecção experimental de macrófagos J774 por Leishmania (L.) infantum chagasi, in vitro.


MATERIAL / MÉTODO

O medicamento de escolha foi o A. crudum nas potências 6CH, 12CH e 30CH, apresentados na forma de glóbulos, diluídos em 15 ml de água miliq destilada, autoclavada e filtrada. No grupo placebo, administrou-se apenas glóbulos diluídos e no grupo controle, não houve administração de diluições.
Para infecção de macrófagos, foi utilizada a cepa de L. (L.) infantum chagasi (MHOM/BR/1972/LD) cultivados em meio 199 (Sigma Aldrich), acrescido de HEPES (40 mM),adenina (0,1mM), biotina (0.1 %), hemina (0,1%), soro fetal bovino (SFB - 20%), penicilina/ estreptomicina (1%), L-glutamina (1% ) e urina (2%), pH 7.2, mantidas a 250C.
Nos ensaios foram utilizados macrófagos J774, cultivados em meio RPMI 1640 (Vitrocell com 10% de SFB) a 370C e 5% de CO2. Foram mantidos em placas de 24 poços com respectivas lamínulas e em cada poço foi adicionado 2,5 x 105 células, aderidos por 12 horas e infectados com promastigotas na proporção de 5:1 (parasitas: macrófagos).
As células foram tratadas com 1% da solução homeopática, e mantidas por 48, 72 ou 96 horas, após a infecção, e então preparadas para imunofluorescência.
O ensaio foi cessado e fixado em 4% de paraformaldeído/PBS e tratadas com 50mM de cloreto de amônia (15 minutos), permeabilizadas e bloqueadas em saponina (0,1%)/ albumina de soro bovino ( 0.1 %)/ azida sódica (0,05%)/PBS e incubadas com solução de permeabilização e bloqueio na presença de anticorpos primários (anti-Leishmania e anti-LAMP1) por 2 horas, seguido da incubação com os respectivos anticorpos secundários (Alexa Fluor 488 e 568 ; Invitrogen) por 1 hora. Os materiais genéticos das células foram marcados com 10µg/ml DAPI (Sigma) por 1 hora. As imagens foram adquiridas (Imagem 1) em um microscópio de fluorescência DMI6000B/AF6000 (Leica) em um sistema de câmera digital (DFC 365 FX), com o programa“Leica AF600” e “Image J” (4)
Para análise estatística, foram realizadas comparações de Dunn’s Multiple e teste de Fisher através do programa GraphPad Instat.(P< 0,001)


RESULTADO

Considerando CT (controle), PL (placebo) e CH6, CH12 e CH30 (potências),observou-se que em 83,3% dos casos, o CT é estatisticamente semelhante ao PL (P< 0,0001).
Na tabela 1, verifica-se:
No experimento I, CH30 teve valores superiores em comparação a CT e PL em relação à A, B e C, mostrando, além de um maior poder fagocítico dos macrófagos, uma maior porcentagem de células infectadas. Já no experimento II, CH12 mostrou-se maior que o controle em relação à A e C e maior que CH6 em B. No experimento III72POS, CH12 teve valores superiores que CT e PL em A, B e C
No ensaio III48POS, verifica-se que, o tratamento com CH6, 12 e 30, houve valores superiores que CT e PL (em A e C). Além disso, observa-se que CH6, além de ser superior a CT e PL(em A e C), também foi superior, à PL, CH12 e CH30, em relação à B.
Já se sabe que para uma resposta imune efetiva na LV, é essencial a formação de estruturas granulomatosas, as quais tem a função de coordenar e liberar células e fatores de defesa do hospedeiro para os tecidos infectados. Apesar de não ser possível alcançar uma cura estéril, o fígado, por albergar uma maior quantidade de parasitas, se torna resistente a re-infecção (5). Nos resultados apresentados, observa-se, em geral, maior porcentagem de macrófagos infectados, assim como, maior taxa de fagocitose nos grupos tratados. Assim, a formação de granuloma pode ser mais intensa, o que promoverá uma resposta imune secundária mais representativa e como consequência, destruição ou fixação do antígeno. Por outro lado, caso não haja formação de granulomas, o quadro agudo poderá ser exacerbado com risco de septicemia.
Baseado nessas informações, pode-se fazer uma associação ao experimento realizado por Santana et al.(3) que mostraram que a administração de A. crudum na fase aguda houve um crescimento mais acentuado do edema e necrose nos animais tratados, sinais estes que, na leishmaniose cutânea, pode significar uma forma de expressão morfológica de reação modificada (granuloma), observado na forma visceral.
Dessa forma, pode-se sugerir que por haver uma maior porcentagem de células infectadas e taxa de fagocitose nos grupos tratados com A. crudum observou-se uma maior ativação do macrófago, que pode gerar uma reação modificada mais intensa e como consequência, a formação do granuloma, resultando na inativação do parasita. Por outro lado, a resposta pode levar a um quadro mais grave da sintomatologia clínica do paciente.
Logo, para uma avaliação mais precisa é necessária uma análise da constituição geral, predisposição e metabolismo do organismo além de mais estudos para maior compreensão do efeito dos medicamentos homeopáticos em cultura celular.

ANEXOS


REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

1. WHO. Leishmaniasis [Internet]. World Health Organization (WHO). 2015 [cited 2015 Jul 1]. Available from: http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs375/en/
2. Brasil. Leishmaniose Visceral. Ministério. Brasília: Secretaria de Vigilancia em Saúde - Departamento de Vigilância Epidemiológica; 2014. 31-64 p.
3. Santana FR De, Cristina E, Hurtado P, Benites NR, Laurenti MD. Modulation of inflammation response to murine cutaneous Leishmaniasis by homeopathic medicines : Antimonium crudum 30cH. Homeopathy. 2014;103(4):264–74.
4. Cortez M, Huynh C, Fernandes MC, Kennedy K a., Aderem A, Andrews NW. Leishmania promotes its own virulence by inducing expression of the host immune inhibitory ligand CD200. Cell Host Microbe. 2011;9:463–71.
5. Kedzierski L, Evans KJ. Immune responses during cutaneous and visceral leishmaniasis. Parasitology [Internet]. 2014;1–19. Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25075460.

Palavras-chave: Homeopatia, in vitro, Leishmaniose, infecção