RESUMO INTRODUÇÃO

Recentemente, alguns trabalhos identificaram nanopartículas (NP) dos materiais originais nas altas diluições de medicamentos homeopáticos acima do número de Avogadro (6,02 x 10-23)1-2. Além de NP, os medicamentos homeopáticos, tradicionalmente preparados em recipientes de vidro, também contêm NP de sílica 1-2-3. A nanotecnologia utiliza a sílica regularmente, na montagem de nanoestruturas específicas baseadas em DNA, proteínas ou outros materiais como moldes epitáxicos estruturais 4-5.
O objetivo do trabalho é comparar o efeito de diluições homeopáticas de Arsenicum preparadas em recipientes de vidro e plástico. Para tanto, escolhemos como modelo experimental a análise do efeito modulador do medicamento Arsenicum 30K preparado em recipiente de vidro e plástico, no processo de fagocitose in vitro, bem como análise de largura e área através de co-cultura de macrófagos com leveduras. Os resultados serão de extrema relevância para a compreensão do mecanismo de ação dos medicamentos homeopáticos, além de terem implicações práticas altamente significativas para a farmácia homeopática, pois determinarão a possibilidade ou não de substituir vidro por plástico no preparo e estoque dos mesmos.

MATERIAL / MÉTODO

Ética: Por se tratar de estudo 100% in vitro, utilizando células de linhagem, a aprovação do comitê de ética da UNIP não foi necessária.
Co-cultura de macrófagos e leveduras: os macrófagos RAW foram descongelados, distribuídas em garrafas de cultura e incubadas a 37°C com 5% CO2, até a adesão dos macrófagos à superfície da garrafa. As células não aderentes foram removidas por lavagem com tampão fosfato (PBS). Em seguida, foi adicionado à garrafa de cultura o meio RPMI suplementado com 20% de soro fetal bovino, 200U ml-1 penicilina, 100U ml-1 estreptomicina e 2.6 µg ml-1 de anfotericina. As células que atingiram 90% de confluência foram ressuspensas, contadas e plaqueadas em fluxo laminar, o plaqueamento foi feito com pipetador automático e pipetas descartáveis, em placas de 6 poços. Foram inseridos 0,5ml do meio contendo 25x105 células por poço. O inóculo (levedura de pão, Saccharomyces cerevisiae) foi adicionado sobre as células aderidas ao fundo do poço na proporção 10:1 e incubado por duas horas. Após esse período, as células foram lavadas em PBS para remoção dos microorganismos não fagocitados. As amostras foram processadas em triplicata. O tratamento das células foi feito pela inclusão de arsenicum 30K ou lactose 30K (veículo), preparados em água ultra-pura e filtrados em filtro Millipore 22 micra, para completa esterilização, em volume equivalente a 20% do volume total do meio de cultura de cada poço. Após 24 horas, um reforço do tratamento foi feito com 1% do volume, utilizando os mesmos medicamentos. As células foram aderidas diretamente à superfície da placa para evitar a contaminação da cultura com a sílica desprendida das lamínulas, o que aconteceria caso utilizássemos o protocolo convencional de fagocitose.Vários procedimentos foram feitos a partir desta etapa: 1) As células aderidas sobre as placas foram fixadas com metanol absoluto por 15 minutos e coradas com Giemsa.

RESULTADO

Resultados:Os macrófagos RAW tratados com arsenicum album 30K e água dinamizada 30K, ambos preparados em plástico, apresentaram aumento estatisticamente significativo em relação aos controles, no que diz respeito à área celular média (p=0,065; Figura 1) e ao índice fagocítico (p=0,049; Figura 2). Não houve significância estatística em relação à largura das células e ao número de leveduras internalizadas. Para confirmação e avaliação da especificidade deste primeiro resultado, uma repetição foi feita, substituindo-se a água dinamizada por água não dinamizada. Os macrófagos RAW tratados com arsenicum 30K preparado em plástico apresentaram aumento estatisticamente significativo na largura dos macrófagos (p=0.0001; Figura 3) em relação aos controles. Não houve significância em relação ao índice fagocítico e ao “spreading”. Também não houve diferença entre os grupos tratados com água não dinamizada preparada em plástico e vidro, em nenhum dos parâmetros analisados. No terceiro experimento, onde testamos o medicamento Arsenicum album 6cH preparados em vidro e plástico, não obtivemos significância estatística em nenhum dos parâmetros analisados, após 24hs de incubação.Discussão:Com este estudo definimos uma potência homeopática capaz de produzir efeitos mensuráveis in vitro (As 30K), bem como de revelar diferenças entre as preparações farmacêuticas feitas em frasco plástico e frasco de vidro. A dinamização da água como controle pode gerar efeitos inespecíficos que dificultam a interpretação dos resultados, conforme demonstrado em estudos feitos anteriormente in vitro (JAGER et al., 2011). Nossos resultados apontam que tais efeitos inespecíficos sobre a ativação macrofágica são ainda mais evidentes quando da preparação dos medicamentos em frasco PET. Tais dados são compatíveis com a literatura e acrescentam evidências de que o uso do plástico como recipiente para preparação de medicamentos homeopáticos pode comprometer a ação medicamentosa, sobretudo quando usado em grande escala.
Em estudo realizado com células humanas (leucócitos) usando uma linhagem de células (MT4), observou-se que as potências homeopáticas de Arsenicum 6cH e 200cH foram capazes de aumentar a viabilidade de células MT4 in vitro, após intoxicação com arsênico As2O3 (IVE et al, 2012). Em outro estudo avaliou-se o efeito dos medicamentos homeopáticos Arsenicum album e arsênico inorgânico em co-culturas de leucemia monocítica humana com linhagem de células THP-1 in vitro. Como resultado, o medicamento arsênico inorgânico produziu aumento das citocinas pró-inflamatórias IL1-beta e TNF-alfa e baixos níveis de citocina anti-inflamatória IL10 6 .
Concluímos que a natureza do material utilizado como frasco para preparação de medicamentos homeopáticos pode interferir na sua atividade biológica, sobretudo em medicamentos preparados na escala Korsakov.

REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA

1-Chikramane PS, Suresh AK, Bellare JR, Kane SG. Extreme homeopathic dilutions retain starting materials: a nanoparticulate perspective. Homeopathy, 2010; (99): 231-242.

2-Upadyhay RP, Nayak C. Homeopathy emerging as nanomedicine. Int J High Dilution Res. 2010 ;( 10):299-310.

3-Bhattacharyya SS, Madal SK, Biswas R, Paul 2, Pathak S, Boujedaini N, Belon P, KHUDA-BUKHSH AR. In vitro studies demonstrates anticancer activity of an alkaloid of the plant Gelsemium sempervirens. Exp Biol Med. 2008; (233): 1591-1601.

4-Belton DJ, Deschaume O, Perry CC. An overview of the fundamentals of the chemistry of silica with relevance to biosilicification and technological advances. FEBS J. 2012; (279):1710-1720.

5-Baca HK, Carnes EC, Ashley CE, Lopez DM, Douhit C, Karlin S, Brinker CJ. Cell-directed assembly: directing the formation of nano/bio interfaces and architectures with living cells. Biochim Biophys Acta. 2011; (1810): 259-267.

6-Marzotto M, Olioso D, Bonafini C, Bellavite P. 2° International Homeopathy Research Conference. 2015, Riliape Turati Rome Italy. Differential dose-dependent effects of arsenic in pro- and anti- inflammatory citokines. Cutting Edge Research in Homeopathy: Fri 5 june. p. 20.

Palavras-chave: homeopatia, hipótese da sílica